Pesquisadores do Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para a Descoberta, Diagnóstico, Genômica e Epidemiologia de Arboviroses (CADDE) concluíram em 18 horas o sequenciamento de todo o genoma do vírus macaco-aranha (MPXV) do primeiro paciente diagnosticado com varíola de macaco demonstrado no Brasil.
O feito tornou-se imaginável graças à adaptação ao MPXV de uma estratégia de metagenômica imediata desenvolvida durante o doutorado de Ingra Morales Claro, bolsista da FAPESP. As pinturas foram coordenadas pela professora Ester Sabino, da Universidade de São Paulo (USP), que também esteve no ritmo do primeiro sequenciamento do SARS-CoV-2 no país, em março de 2020, e dos primeiros casos da nova variante gama, que surgiu em Manaus cerca de um ano depois.
A equipe do CADDE publicou os resultados (06/09) no virological. org, site onde virologistas de todo o mundo apresentam dados percentuais sobre patógenos de interesse em tempo real.
“Ganhamos um padrão de internação de paciente no Hospital Emílio Ribas às quatro horas da tarde de terça-feira [06/07] e às 10 horas da manhã seguinte, o genoma do vírus, que tem apenas cerca de 200 mil pares de base [muito mais do que os 30 milhões de SARS-CoV-2], sequenciado e analisado. O método que desenvolvemos é, em média, 45% mais rápido que as técnicas metagenômicas tradicionais. E o custo também é menor, alcançando US$ 30 de acordo com o padrão”, diz Claro à Agência FAPESP.
Como explica Sabino, os cientistas recorrem à análise metagenômica quando querem identificar um novo vírus emergente (como foi o caso do SARS-CoV-2 em 2019) ou tropeçar em um vírus já conhecido em amostras de pacientes sem ter os reagentes rápidos que procuravam em mãos. . (como é agora o caso do MPXV).
Na verdade, o teste RT-PCR, o ouro popular para diagnosticar Covid-19 e várias outras doenças, requer os chamados primers, que são sequências de nucleotídeos complementares às sequências virais que iniciam a replicação do material genético. E o resultado terá que ser comparado a controles negativos e positivos.
“Quando um surto começa com um novo agente infeccioso, um dos principais gargalos para diagnosticar casos é a falta de primers rápidos e controles positivos. Essa estratégia pode ser útil nessas situações, pois torna imaginável identificar patógenos ainda desconhecidos, para os quais não há reagentes”, diz Sabino.
E quanto mais cedo for detectado o caso do “índice” (o primeiro caso), maior será o caso de conter um vírus emergente, acrescenta a Claro.
No caso da metagenômica, primers aleatórios (não expressos para um vírus específico ou bactéria) são usados para ser toda a rede genética contida em uma amostra biológica, adicionando a do hospedeiro (humano, neste caso) e outros patógenos que possivelmente portam. Esses dados são então analisados por meio de técnicas de bioinformática e comparados a um painel de referência.
“Exatamente como foi feito com o MPXV. O conhecimento recebido mapeou um número do vírus que já estava disponível para estudos. E isso nos permitiu descobrir que era macacopox”, diz ele, é claro.
encurtar caminhos
A confirmação oficial do primeiro caso brasileiro de macacopox foi feita (06/09) através do Instituto Adolfo Lutz. O Laboratório de Referência de São Paulo realizou a pesquisa de metagenômica em uma plataforma conhecida como Illumina, uma das tecnologias utilizadas para encontrar MPXV na Europa e centros norte-americanos e considerada o padrão-ouro. A sequência através desta abordagem leva em média 48 horas.
A organização CADDE usou uma série conhecida como MinION, da Oxford Nanopore Technologies, e fez adaptações ao protocolo usado para serializar os vírus Zika (desde 2015) e SARS-CoV-2 (desde 2020), tornando-o o mais rápido.
“Um desses novos protocolos é o alívio no tempo de elaboração de padrões para sequenciamento de 14 horas a 5h40 minutos”, diz Claro.
Com uma taxa de erro ligeiramente maior do que a plataforma Illumina, a equipe do CADDE procurou gerar até trezentos leituras redundantes para cada região do genoma viral. “Quando você passa pela mesma região várias vezes e encontra o mesmo resultado, você pode ter certeza de que não é um erro de leitura”, diz o pesquisador.
O próximo passo para reunir a remota árvore filogenética MPXV no Brasil. Para isso, a equipe do CADDE comparou a série recebida na USP com outras 102 publicadas este ano por cientistas de países como Bélgica, Portugal, Reino Unido, Alemanha, Espanha e Estados Unidos. O propósito de medir o grau de semelhança entre as séries, que fornece pistas sobre as relações evolutivas.
“Baixamos todos os genomas completos sequenciados em 2022 [até 06/09], alinhamos as sequências e montamos a árvore filogenética. Notamos que o MPXV detectado aqui é um componente de um clado gigante [grupo], assim como vírus sequenciados na Europa e nos Estados Unidos. Quando comparamos com o genoma de referência do CDC [Centro Norte-Americano de Controle de Doenças], atualizado em maio, só observamos 3 mutações”, diz ele claramente.
Para comparação, o primeiro genoma MPXV sequenciado em 2022 teve 47 mutações em relação ao último caso descrito até hoje (em 2018, na África).
“O que essas mutações consistem e se elas contribuíram de alguma forma para o acúmulo do número de instâncias é algo que ainda está sendo estudado em outros grupos de estudo. No CADDE, estaremos atentos a instâncias de longo prazo. O conceito é continuar sequenciando para se ater à evolução do vírus”, revela Claro.
Embora seja conhecido por causar varíola, o MPXV é um vírus que basicamente infecta roedores na África. O patógeno é um componente da família Ortooxo, juntamente com o vírus da varíola humana, que foi eliminado em 1980.
A doença começa com febre, cansaço, dor de cabeça, dor muscular, ou seja, sintomas não específicos, hemorrágicos ou parecidos com gripe. Poucos dias após o início da febre, as lesões aparecem na pele, implicando uma maior carga viral. O contágio ocorre por contato direto com feridas ou com roupas, lençóis e toalhas usadas por um usuário com lesões cutâneas. Também pode ocorrer de tosse ou espirro de pessoas inflamadas.
Até o início deste ano, a infecção não era incomum na África Central, mas novos casos já foram detectados em 33 países, a maioria sem histórico da doença.
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