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Pesquisa: sensor detecta dengue antes dos primeiros sintomas da doença

Publicado em 09 fevereiro 2015

Agência FAPESP – Pesquisadores do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo (IFSC-USP) e da empresa DNApta Biotecnologia, de São José do Rio Preto (SP), desenvolveram um biossensor capaz de detectar dengue antes de surgirem os primeiros sintomas da doença.

O dispositivo, criado durante um projeto de mestrado da estudante Alessandra Figueiredo e de um pós-doutorado realizado por Nirton Cristi Silva Vieira com Bolsa da FAPESP, foi desenvolvido no Grupo de Nanomedicina e Nanotoxicologia do IFSC-USP, coordenado pelo professor Valtencir Zucolotto, e no âmbito do Instituto Nacional de Eletrônica Orgânica (INEO) – um dos Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia (INCTs) financiados pela FAPESP e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) -- pelo professor Francisco Guimarães. E foi descrito em um artigo publicado na revista Scientific Reports, do grupo Nature.

“O biossensor é capaz de diagnosticar dengue com maior rapidez, menor custo e facilidade do que os testes laboratoriais existentes hoje”, disse Vieira, pós-doutorando no IFSC-USP e um dos autores do projeto, à Agência FAPESP.

A tecnologia do biossensor é baseada na detecção elétrica da proteína não-estrutural 1 NS1. Esse tipo de proteína é secretada pelos quatro tipos de vírus da dengue (DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4) e encontrado em concentrações detectáveis no sangue de pessoas tanto com infecção primária (que contraíram a doença pela primeira vez) quanto secundária (a partir da segunda vez), do segundo até o nono dia após o início da doença. Por isso, é considerada um excelente biomarcador de infecção pelo vírus da dengue, de acordo com Vieira.

“A vantagem de utilizar a proteína NS1 para detectar dengue é que é possível diagnosticar a doença mais precocemente, já no segundo ou terceiro dia após a infecção, uma vez que os sintomas da dengue só começam a aparecer, em média, a partir do sexto dia após a picada do mosquito”, disse o pesquisador.

Uma das formas usadas para detectar a proteína NS1 do vírus da dengue é por meio de anticorpos como a imunoglobulina G (IgG), obtidos por meio da fusão de linfócitos B provenientes do baço de animais imunizados com células de mieloma (linhagem tumoral de linfócitos B) ou extraídas do sangue de mamíferos inoculados com NS1.

O problema, contudo, é que o custo desse processo de fusão de linfócitos B é muito alto. Já a quantidade de anticorpos obtida por meio do sangue de mamíferos inoculados com NS1 é muito pequena, ressalvou Vieira. “O rendimento desse processo é muito baixo”, disse.

A fim de aumentar a produção de anticorpos da proteína NS1, a empresa DNApta Biotecnologia desenvolveu uma técnica na qual são produzidas em bactérias Escherichia coli (E. Coli) proteínas recombinantes (feitas artificialmente, a partir de genes clonados) de NS1 dos quatro tipos de vírus da dengue, que são inoculadas em galinhas poedeiras.

Com isso, ela consegue obter, da gema dos ovos das galinhas inoculadas com proteínas recombinantes NS1, grandes quantidades de imunoglobulina do tipo IgY – alternativa à imunoglobulina IgG, obtida a partir do sangue de mamíferos.

“As galinhas são grandes produtoras de anticorpos. Conseguimos obter uma quantidade muito grande de IgY da gema do ovo de poedeiras inoculadas com NS1”, contou Sérgio Moraes Aoki, diretor científico da DNApta.

A empresa forneceu proteínas recombinantes de dengue NS1 e imunoglobulina IgY da gema de ovo para os pesquisadores do IFSC-USP desenvolverem o biossensor de dengue e divide com a Agência USP de Inovação a patente do dispositivo.

“Foi a primeira vez que se utilizou imunoglobulina IgY de galinha como elemento de reconhecimento biológico em um biossensor voltado ao reconhecimento da proteína NS1”, disse Aoki.

Composição do sensor

O biossensor desenvolvido pelo grupo de pesquisadores é composto por um eletrodo de ouro em escala nanométrica (da bilionésima parte do metro) com uma amostra de imunoglobulina IgY imobilizada sobre ele e um eletrodo de referência com potencial elétrico constante.

Ao entrar em contato com a proteína NS1, o potencial elétrico do eletrodo com a imunoglobulina IgY imobilizada muda em relação ao do eletrodo de referência, em razão da ligação da proteína com o anticorpo, produzindo um sinal elétrico.

Um software “lê” esse sinal elétrico e indica em, no máximo, 30 minutos o resultado da análise, que pode ser acessado em tempo real pelo celular ou notebook.

“Quanto maior for a concentração da proteína NS1 em contato com o eletrodo com a imunoglobulina IgY imobilizada, maior também será a diferença do potencial elétrico”, explicou Vieira.

A fim de avaliar a eficácia do biossensor, os pesquisadores realizaram testes com amostras da proteína NS1 em concentrações que variaram de 0,01 a 10 microgramas por mililitro (μg.mL) – a faixa limite de concentração de NS1 encontrada no sangue de pacientes diagnosticados com dengue.

Os resultados dos testes indicaram que o dispositivo foi capaz de detectar a presença da proteína NS1 em uma concentração mínima de 0,09 μg.mL.

“A média de concentração da proteína NS1 no sangue de pessoas infectadas pelo vírus da dengue é de 2 microgramas por mililitro. O biossensor conseguiu detectar concentrações muito menores do que essa”, disse Vieira.

Os pesquisadores obtiveram a aprovação inicial do comitê de ética da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) para realizar, nos próximos meses, após aprovação final, testes do biossensor diretamente em amostras de sangue de pessoas infectadas com o vírus da dengue.

“Já chegamos a desenvolver um protótipo do sensor”, disse Vieira. “A vantagem é que a imunoglobulina IgY obtida de gema de ovo usada nele é muito barata em comparação com outros anticorpos. Por isso, o dispositivo poderia ser produzido em larga escala."