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Pesquisa realizada na Unicamp traz resultados animadores sobre a inibição de Listeria monocytogenes em queijos artesanais

Publicado em 27 agosto 2018

É sabido que os queijos artesanais à base de leite cru são mais suscetíveis à contaminação por bactérias causadoras de doenças, como a Listeria monocytogenes, principalmente quando fabricados sem os devidos cuidados higiênico-sanitários. Fernanda Bovo Campagnollo, pesquisadora de pós-doutorado na Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), sob orientação do professor Anderson de Souza Sant’Ana, obtiveram resultados animadores para produção de queijos em pesquisa realizada no laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos. Os pesquisadores selecionaram seis cepas de bactérias láticas com capacidade de inibir o crescimento da Listeria monocytogenes em queijo Minas frescal e de inativar a bactéria no queijo Minas curado. Além disso, o tempo de maturação do queijo curado foi reduzido.

Hoje, o tempo de maturação dos queijos artesanais, produzidos com leite cru, permitido pela legislação federal é de 60 dias. Este período é importante para a eliminação de patógenos no queijo e garantir sua segurança. Porém, para queijos produzidos em queijeiras de região de indicação geográfica certificada, este período é variável. No caso do queijo Minas artesanal curado, o período de maturação tem duração específica para cada microrregião produtora, sendo de 14 dias para o queijo de Araxá, de 17 para o Serro, e de 22 dias paras os queijos produzidos nas demais regiões do estado de Minas Gerais. Este período foi definido por meio de estudos técnicos-científicos que comprovaram a segurança microbiológica dos queijos.

Em função da forma artesanal de produção do queijo Minas – que durante o processo é muito manipulado e passível de contaminação microbiana – são necessárias algumas ações para garantir a seguridade do produto. Assim, para se obter um produto de qualidade e seguro para o consumo é necessário que os produtores sigam uma série de cuidados, como o controle sanitário do rebanho, a obtenção higiênica do leite, a utilização das boas práticas de fabricação, do tempo mínimo de maturação e o registro da queijaria. Porém, nem todos os produtores seguem esses cuidados, resultando na contaminação do queijo por microrganismos patogênicos, dentre eles a Listeria monocytogenes. Para resolver o problema da contaminação do queijo e da diminuição do tempo de maturação, a pesquisadora buscou a solução no próprio queijo.

Muitos estudos mostraram que as bactérias lácticas isoladas de queijo produzem bacteriocinas – compostos com atividade antimicrobiana, capazes de impedir o crescimento de microrganismos patogênicos, inclusive Listeria. Porém, não havia estudos sobre a utilização de cepas de bactérias lácticas para combater a Listeria em queijos, como o queijo Minas frescal e o curado. Os pesquisadores da Unicamp coletaram amostras de queijos Minas artesanal em cinco microrregiões tradicionais em Minas Gerais – Araxá, Campo das Vertentes, Canastra, Cerrado e Serro. A partir dessas amostras de queijo foram isoladas cepas de bactérias lácticas. Após uma série de testes laboratoriais, seis cepas de bactérias láticas, com elevada capacidade em inibir o crescimento da Listeria monocytogenes, foram selecionadas.

Os queijos Minas frescal foram avaliados ao longo de 15 dias sob refrigeração e o queijo Minas curado foi avaliado ao longo de 22 dias de maturação. Os pesquisadores observaram como essas cepas de bactérias selecionadas influenciaram o desenvolvimento da Listeria e o tempo de maturação do queijo curado, quando comparados com amostras de queijo sem adição das misturas de bactérias. Os resultados mostraram que estas cepas quando aplicadas na produção do queijo foram eficazes para interromper o crescimento da Listeria no queijo Minas frescal (efeito bacteriostático) e de inativar o patógeno no queijo Minas curado (efeito bactericida).

Confira abaixo a entrevista realizada com a pesquisadora Fernanda Bovo Campagnollo:

O queijo Minas artesanal é um queijo de leite cru amplamente consumido e muito apreciado. Como surgiu a ideia para a sua pesquisa?

As diferentes variedades de queijos Minas artesanais, algumas produzidas há mais de 200 anos, vêm apresentando consumo crescente e grande apreciação entre os consumidores brasileiros devido às suas características peculiares, como sabor acentuado e uso de matérias-primas diferenciadas e selecionadas, além de incluir em cada tipo de queijo a influência das condições climáticas e geográficas de cada região onde são produzidos. Destaca-se que com o aumento do interesse por queijos artesanais, muitos produtores vêm se especializando, buscando aumentar a qualidade do seu produto e atender à legislação pertinente para poder realizar a sua comercialização em nível nacional, e não apenas regional ou estadual.

Apesar do aumento no consumo e do interesse por parte dos produtores em oferecer produtos de maior qualidade, a produção artesanal de queijos, principalmente aquela que utiliza o leite cru, traz algumas preocupações como o controle da sanidade do rebanho, nível de atendimento às boas práticas de fabricação na produção do queijo, adequação das instalações e equipamentos, qualidade das matérias-primas, além de muitos produtores realizarem a produção e a comercialização dos queijos informalmente. Se as condições mínimas de higiene não forem atendidas, microrganismos patogênicos como, por exemplo, Listeria monocytogenes, podem contaminar o ambiente de produção e consequentemente o queijo.

Porém, a matriz do queijo é um sistema complexo que apresenta vários fatores de competição microbiana contra patógenos, que quando ajustados de maneira adequada, podem agir como barreiras à multiplicação desses microrganismos. Dentre esses fatores de competição microbiana, destacam-se as próprias características intrínsecas do queijo (baixa atividade de água, baixo pH e elevado teor de sal) e a presença de bactérias ácido láticas, sejam estas endógenas (com origem no próprio leite) ou adicionadas propositalmente (através de culturas iniciadoras). Tais bactérias são capazes de produzir compostos antimicrobianos como ácido lático, peróxido de hidrogênio, diacetil e bacteriocinas.

Entretanto, nem todas as bactérias láticas são capazes de produzir esses compostos ou de produzi-los em quantidade suficiente para inibição dos patógenos, sendo necessária a seleção daquelas com atividade antilisterial, por exemplo. Dado o exposto, nosso projeto de pesquisa objetivou a coleta de amostras de queijos Minas artesanais de diferentes regiões produtoras do estado; o isolamento das bactérias láticas com atividade antilisterial a partir de testes laboratoriais; seleção das cepas com maior atividade para criação de uma mistura padronizada de bactérias láticas; e, finalmente, aplicação dessa mistura de bactérias láticas na produção dos queijos estudando-se a sua capacidade de inibir o desenvolvimento ou causar a inativação da Listeria monocytogenes, além de analisar o efeito na redução do tempo de maturação. Em adição ao queijo curado, essa mistura de bactérias láticas foi aplicada em queijo Minas frescal, já que o consumo desse produto no Brasil é amplamente difundido.

Além do presente projeto, existe outro projeto sendo concluído em nosso laboratório, o qual realizou um estudo extenso sobre a ecologia microbiana de queijos coloniais e artesanais brasileiros de várias regiões. O estudo vai revelar também dados sobre a incidência e contagem de patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus em mais de 500 amostras de queijos artesanais e coloniais, coletados de norte a sul do Brasil. Dados sobre a composição química também serão apresentados. Ambos os projetos receberam financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

Como sua pesquisa vai contribuir para a produção de queijos artesanais, sem que os mesmos percam suas características?

Nosso objetivo foi isolar bactérias láticas com capacidade antilisterial das próprias amostras de queijos Minas artesanais de forma que essas bactérias quando aplicadas nesses queijos não alterassem as suas características. A microbiota existente no queijo é bastante diversa e inclui diferentes espécies e cepas de bactérias láticas, motivo pelo qual nós escolhemos criar uma mistura padronizada de bactérias láticas selecionadas ao invés de se utilizar apenas uma cepa com atividade antilisterial. Agora que comprovamos a atividade antilisterial da mistura, nosso próximo passo é testar a influência dessas cepas nas características sensoriais do queijo. Portanto, nossa pesquisa visa contribuir para uma produção de queijo artesanal mais segura.

A legislação brasileira exige que queijos curados produzidos com leite cru sejam maturados por no mínimo 60 dias a fim de garantir a segurança microbiológica do produto (MAPA, 2000). Tais produtos só podem ser maturados por um tempo menor caso o produtor comprove através de estudos técnico-científicos que a redução do período de maturação não compromete a qualidade e inocuidade do produto (MAPA, 2011). Nossos resultados mostraram que as células de Listeria monocytogenes foram sendo inativadas ao longo do período de maturação, não sendo mais detectadas após 15 dias no caso dos queijos curados produzidos com leite cru e após 21 dias nos queijos curados produzidos com leite pasteurizado, enquanto que nos grupos controle o patógeno conseguiu sobreviver ao longo de todo o período estudado. Tradicionalmente, maturam-se os queijos Minas artesanais por um período de 17 a 22 dias, sendo assim, o uso das bactérias láticas com atividade antilisterial pode contribuir para que esses produtores artesanais possam comercializar seus queijos com um tempo menor de maturação.

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2000. Resolução Nº 7, de 28 de Novembro de 2000. Critérios de funcionamento e de controle da produção de queijarias, para seu relacionamento junto ao serviço de inspeção federal. MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2011. Instrução Normativa Nº 57, de 15 de Dezembro de 2011. Critérios adicionais para produção de queijo artesanal.

Sua pesquisa foi sobre a seleção e atividade antilisterial de bactérias láticas em queijos artesanais. Como essas bactérias láticas atuam no combate à Listeria nos queijos?

As bactérias láticas selecionadas apresentam uma elevada atividade antilisterial, isto é, dentre todas as cepas isoladas e testadas para essa característica, apenas 6 cepas foram selecionadas devido à sua capacidade de inibir/inativar o crescimento de Listeria monocytogenes em meio laboratorial e posteriormente em queijos Minas frescal e curado. O combate à Listeria nos queijos é realizado através de um mecanismo de competição por nutrientes e pela produção de compostos com ação antimicrobiana. As bactérias láticas conseguem se desenvolver mais rapidamente que o patógeno, evitando assim que ocorra a multiplicação ou sobrevivência deste no queijo.

Os testes realizados apontaram que, no caso do queijo Minas frescal, as bactérias selecionadas foram capazes de impedir a multiplicação da Listeria monocytogenes, exercendo um efeito bacteriostático, enquanto no caso do queijo Minas curado, as bactérias láticas apresentaram a capacidade de inativar as células desse patógeno, exercendo um efeito bactericida. O efeito de inibição/inativação das bactérias láticas sobre a Listeria foi maior no queijo curado devido à associação dos compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias láticas às propriedades intrínsecas mais desfavoráveis ao crescimento do patógeno, como menor atividade de água e menor pH, além de maior concentração de sal.

Sobre as bactérias láticas selecionadas em sua pesquisa, quais são suas expectativas para a sua aplicação na produção de queijos artesanais?

O projeto foi desenvolvido no laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos (LMQA) da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) sob a supervisão do professor Dr. Anderson de Souza Sant’Ana. Estamos buscando parceiros interessados em utilizar as culturas e que queiram colaborar para a continuidade do projeto e desenvolvimento do produto em um formato que possa ser comercializado pelos produtores de queijo. Adicionalmente, temos planos de estudar como estas (e outras) bactérias láticas podem ser combinadas visando à melhoria de outras características dos queijos, como propriedades sensoriais, textura, etc.

Outro projeto financiado pela FAPESP e que está sendo desenvolvido no LMQA está estudando o melhoramento de cepas de bactérias láticas isoladas destes queijos usando a técnica de engenharia evolutiva. Na prática, seria um melhoramento destas bactérias baseando-se na seleção natural após sua exposição continuada a fatores seletivos (“pressões seletivas”). A ideia é obter cepas mais eficazes na inibição de alguns patógenos, sendo robustas também para redução do tempo de maturação. Nosso laboratório de pesquisa está sempre buscando novos parceiros interessados em aplicar nossos produtos e também a criar novos produtos, assim como estamos abertos ao desenvolvimento de projetos que busquem solucionar problemas comuns ao dia-a-dia dos produtores de leite e derivados, seja no âmbito industrial ou artesanal.

O artigo Selection of indigenous lactic acid bacteria presenting anti-listerial activity, and their role in reducing the maturation period and assuring the safety of traditional Brazilian cheeses (doi: 10.1016/j.fm.2018.02.006), pode ser lido na revista Food Microbiology (www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002017310717).