Um novo estudo descreve como o funcionamento do[{” attribute=””>RNA changes in cells infected by SARS-CoV-2, the COVID-19 virus. The findings provide clues as to how different variants can escape the immune system, and serve as a basis for the development of novel treatments.
For the first time, scientists have shown that infection by SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19, changes the functioning of host cell RNA. The researchers, from the Federal University of São Paulo (UNIFESP) in Brazil, arrived at this conclusion by analyzing 13 datasets obtained during four studies of viral, human, and animal cell RNA.
The most recent study, reported in an article published in the journal Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, examined the epitranscriptome of Vero cells (derived from monkeys) and human Calu-3 cells by direct RNA sequencing. An epitranscriptome is the collection of biochemical modifications of cell RNA, such as methylation.
“Our first important finding in this study was that infection by SARS-CoV-2 increases the level of m6a [N6-methyladenosine], um tipo de metilação, em células hospedeiras em comparação com células não infectadas”, disse à Agência FAPESP Marcelo Briones, último autor do artigo. Briones é professor da Faculdade de Medicina da UNIFESP (EPM) e pesquisador vinculado ao seu Centro de Bioinformática Médica.
A metilação é uma modificação bioquímica que envolve a adição de um grupo metil a um substrato. Ocorre nas células por meio da ação de enzimas capazes de transferir parte de uma molécula para outra. Isso muda o comportamento de proteínas, enzimas, hormônios e genes. Os pesquisadores demonstraram alterações no RNA das células infectadas quantitativamente, analisando todos os RNAs presentes nas células e qualitativamente, localizando em um mapa o número de metilações por região nos nucleotídeos.
O estudo foi a continuação de um análise genômica anterior publicado em 2021, onde os pesquisadores analisaram o padrão de metilação no SARS-CoV-2.
“A metilação tem duas funções nos vírus. Ele regula a expressão de proteínas e defende o vírus contra a ação do interferon, um potente antiviral produzido pelo organismo hospedeiro”, disse Briones.
Em ambos os estudos, os pesquisadores analisaram o m6a porque é o tipo mais comum de modificação de nucleotídeos de RNA e está envolvido em vários processos significativos, como localização intracelular e tradução de proteínas. Os nucleotídeos de RNA contêm bases nitrogenadas (adenina, guanina, uracila ou citosina) correndo ao longo de uma única fita. A equipe também descobriu que diferentes cepas do vírus apresentavam variações nas sequências de bases nitrogenadas em seus nucleotídeos. “Algumas cepas podem ser muito mais metiladas do que outras. Nesse caso, eles podem se proliferar melhor dentro das células hospedeiras”, disse Briones.
Eles também descobriram que as sequências de nucleotídeos conhecidas como motivos m6a DRACH eram ligeiramente diferentes no SARS-CoV-2 e nas células. Nessa sigla, muito usada em epigenética, a letra D significa adenina, guanina ou uracil; R para adenina ou guanina; A para o resíduo metilado; C para citosina; e H para adenina, citosina ou uracilo.
O vírus utiliza enzimas celulares para sua própria metilação, produzindo pressão evolutiva para adaptação das sequências DRACH virais para que se tornem mais semelhantes às sequências celulares. As cepas virais que se adaptam melhor são capazes de escapar do interferon com mais sucesso.
Depois de concluir a investigação de como o SARS-CoV-2 modifica o m6A nas células hospedeiras, o próximo passo dos cientistas será analisar os dados armazenados em busca de uma correlação entre os níveis de metilação do RNA viral e o número de vírus liberados de cada célula infectada, conhecido como tamanho da explosão viral.
“Quanto mais metilados os vírus, mais eles crescem no citoplasma da célula e maior o tamanho da explosão”, explicou Briones. Em condições normais, sem estímulos, uma partícula viral se replica mil vezes. “As descobertas abrem caminho para novos tratamentos para COVID-19 e reaproveitamento de medicamentos conhecidos.” Eles também oferecem elementos para uma compreensão mais profunda de como as cepas virais escapam do sistema imunológico.
Metodologia
O método de sequenciamento direto de RNA Nanopore (Oxford Nanopore Technologies) usado no estudo tem várias vantagens, de acordo com os pesquisadores. Uma delas é que dispensa as modificações exigidas pelo método convencional (reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa, ou RT-PCR) para ler a fita de RNA.
Para examinar um vírus usando RT-PCR, os cientistas devem primeiro converter seu RNA em[{” attribute=””>DNA (reverse transcription). The result is cDNA, where the ‘c’ stands for complementary. This is because only DNA (which is double-stranded) can be copied. The cDNA is then amplified by being copied hundreds of thousands of times, creating billions of clones so that enough of the target sections of viral DNA are available for analysis, instead of a minuscule amount.
For Briones, researchers may be confused by distortions resulting from the production of viral sequences from cDNA. “Some scientists think nucleotides are switched owing to the presence of epigenetically modified bases. This needs to be investigated in a systematic manner,” he said.
The increase in cell methylation was mapped by two m6A detection programs. One of these (m6anet) used a machine learning technique called multiple instance learning (MIL). The other (EpiNano) validated the results using a technique called support vector machine (SVM).
Reference: “The epitranscriptome of Vero cells infected with SARS-CoV-2 assessed by direct RNA sequencing reveals m6A pattern changes and DRACH motif biases in viral and cellular RNAs” by João H. C. Campos, Gustavo V. Alves, Juliana T. Maricato, Carla T. Braconi, Fernando M. Antoneli, Luiz Mario R. Janini and Marcelo R. S. Briones, 16 August 2022, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology.
DOI: 10.3389/fcimb.2022.906578
The study was part of a Thematic Project (“Investigation of induced host elements in response to immunization with ChAdOx1 nCOV-19 vaccine in a Phase III clinical trial”), for which the principal investigator is Luiz Mário Janini, penultimate author of the article.
The research team also included Juliana Maricato, Carla Braconi, Fernando Antoneli, João H. C. Campos, first author of the article supported by a postdoctoral fellowship from FAPESP, and Gustavo V. Alves, second author and an undergraduate in health information technology.