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Mundo Agropecuario (Venezuela)

Identificación de mecanismos de resistencia a plaguicidas en garrapatas bovinas

Publicado em 04 junho 2021

En Brasil, este parásito es actualmente resistente en mayor o menor medida a todos los plaguicidas comerciales utilizados por los ganaderos. El fármaco antiparasitario más utilizado para controlar las poblaciones de garrapatas del ganado (así como los parásitos humanos) es la ivermectina, un antihelmíntico, acaricida e insecticida de amplio espectro.

El rebaño de ganado comercial de Brasil ascendió a 217,7 millones de animales en 2017, según el Ministerio de Agricultura del país. En el mismo año, Brasil fue el principal exportador mundial de carne vacuna, con un envío total de 6.280 millones de dólares.

Las cifras podrían ser incluso mayores si no fuera por la enorme pérdida económica anual causada por los parásitos. Se estima que esta pérdida alcanzó al menos US $ 13,9 mil millones en 2014. En otras palabras, el daño causado por los parásitos en términos de mortalidad , pérdida de peso, fertilidad deteriorada y rendimiento reducido es más del doble del valor de las exportaciones anuales.

El peor daño lo provocan los parásitos internos, como los gusanos gastrointestinales, que provocan pérdidas por valor de 7.100 millones de dólares (51% del total). Luego vienen los parásitos externos, que viven en la piel del ganado o los visitan para alimentarse. Ninguno causa más daño que la garrapata del ganado del sur (Rhipicephalus (Boophilus) microplus), que representa pérdidas anuales que ascienden a US $ 3.200 millones (23,2 por ciento). La mosca de los cuernos (Haematobia irritans) causa pérdidas por US $ 2.5 mil millones (18,3 por ciento), mientras que el daño causado por la mosca bot (Dermatobia hominis), la mosca del gusano barrenador (Cochliomyia hominivorax) y la mosca del establo (Stomoxys calcitrans) asciende a US $ 1.000 millones. (7,5 por ciento).

Un artículo publicado recientemente en Scientific Reports describe un estudio en el que investigadores brasileños afiliados al Departamento de Genética y Biología Evolutiva del Instituto de Biociencias de la Universidad de São Paulo (IB-USP) y el Instituto de Investigaciones Veterinarias Desidério Finamor (IPVDF) en Eldorado do Sul (Estado de Rio Grande do Sul) identificó los mecanismos de resistencia de la garrapata bovina a la ivermectina , uno de los fármacos más utilizados para combatir R. microplus.

La investigación fue apoyada por la Fundación de Investigaciones de São Paulo — FAPESP y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq).

“La infestación ocurre cuando la garrapata se alimenta de la sangre del animal, ya que al hacerlo inocula al animal con sustancias antihemostáticas, antiinflamatorias e inmunomoduladoras contenidas en su saliva”, dijo Tatiana Teixeira Torres, quien realizó el estudio con la genetista Valéria Lis Le. Gall y Guilherme Marcondes Klafke.

Según Torres, estas sustancias modifican la fisiología del huésped alrededor de la picadura, provocando pérdida de sangre y una reducción de la inmunidad e irritación. «El estrés que experimenta el animal debido a la infestación lo lleva a dejar de alimentarse, perder peso y volverse menos fértil», dijo.

«La ivermectina actúa como un análogo de un neurotransmisor llamado GABA, que se encuentra en vertebrados e invertebrados», dijo Torres. «En el caso de la garrapata del ganado, este neurotransmisor actúa uniéndose y activando los receptores de los canales de cloruro activados por glutamato, que son neurorreceptores exclusivos de los invertebrados. El fármaco actúa a nivel molecular, uniéndose a los canales de cloruro neuronal en la unión neuromuscular y bloqueando la neurotransmisión, que paraliza los músculos del insecto y causa la muerte «.

La ivermectina se descubrió en 1975 y ha estado en uso comercial desde 1981. En el caso de la garrapata del ganado, esto significa que innumerables generaciones de R. microplus han estado expuestas al fármaco durante más de tres décadas, el tiempo suficiente para que el insecto desarrolle resistencia a eso.

Según Torres, varios mecanismos en R. microplus pueden estar involucrados en su resistencia a la ivermectina, incluida la capacidad fisiológica para desintoxicar o tolerar sustancias tóxicas. «Los mecanismos metabólicos de la desintoxicación están mediados por familias de enzimas y por proteínas específicas, que han asumido este papel a través del mecanismo de selección natural», dijo.

Las garrapatas que carecían de estas enzimas y proteínas morían en presencia de ivermectina, mientras que las garrapatas que producían las sustancias en cuestión sobrevivían y producían más descendencia, que formaba las cepas resistentes a la ivermectina .

Las familias de enzimas que median la desintoxicación en la especie, explicó Torres, incluyen el citocromo P450, las esterasas y las glutatión-S-transferasas (GST).

«Otras proteínas, como los transportadores ABC, también contribuyen al proceso de desintoxicación al transportar sustancias tóxicas al exterior de las células a través del consumo de ATP», dijo Torres, quien realizó el estudio financiado por la FAPESP.

Bioensayos letales

La desintoxicación de plaguicidas mediante un aumento de la actividad del citocromo P450, esterasas, GST y transportadores ABC es bien conocida en varios grupos de artrópodos, incluida la garrapata del ganado R. microplus.

«En nuestro estudio, investigamos los mecanismos de desintoxicación que funcionan en una cepa de R. microplus resistente a la ivermectina en comparación con una cepa que es susceptible al pesticida», dijo Torres.

«Analizamos la desintoxicación de la ivermectina en ambas cepas mediante bioensayos de tiempo letal en presencia de inhibidores que bloquean la actividad enzimática o transportadora de las proteínas estudiadas, permitiendo que prevalezcan los efectos tóxicos de la ivermectina y por tanto aumentando la tasa de mortalidad».

El objetivo del estudio fue identificar las proteínas que desempeñan un papel clave en la desintoxicación de la ivermectina en una cepa de garrapatas de ganado multirresistente. Para probar la influencia de estas proteínas en la resistencia a los medicamentos, los investigadores utilizaron inhibidores específicos de cada familia de proteínas y compararon las tasas de mortalidad resultantes del tratamiento con ivermectina con o sin inhibidores.

Los inhibidores eran sustancias capaces de inducir alteraciones que impiden la actividad detoxificación: butóxido de piperonilo (PBO) para citocromo P450, S, S, S-tributil fosforotritioato (DEF) para esterasas, maleato de dietilo (DEM) para GST y ciclosporina A (CsA) para transportadores ABC.

En los bioensayos se utilizaron dos cepas de R. microplus. La cepa susceptible fue Mozo, originaria de Uruguay y utilizada en pruebas para el diagnóstico de resistencias en América Latina. Se mantuvo a IPVDF sin contacto con acaricidas.

Según Torres, la cepa resistente a la ivermectina fue Juárez, aislada en 2010 en el municipio de Jacareí, Estado de São Paulo. Originalmente se recolectó de garrapatas hembras de ganado congestionadas en una granja de ganado donde se había informado de fallas en el control de las poblaciones de garrapatas con ivermectina. Juárez es una cepa multirresistente con baja mortalidad por otros pesticidas además de la ivermectina, como cipermetrina, amitraz, clorpirifos y fipronil. El estudio realizado en IB-USP se limitó a la ivermectina.

Se realizaron dos baterías separadas de bioensayos letales. El primero fue diseñado para medir la acción letal de la ivermectina sola en Mozo, la cepa susceptible, y Juárez, la cepa resistente. Se colocaron aproximadamente 100-150 larvas de garrapatas en un paquete de papel, que se incubó durante diez minutos en una solución que contenía ivermectina.

Según Torres, cuando se retiró el paquete de la solución, la mortalidad se midió contando el porcentaje de larvas en cada muestra que murieron después de una determinada exposición a ivermectina. Esta medición se realizó a los 10 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas y 24 horas.

«Los resultados de la primera batería de bioensayos de tiempo letal mostraron una clara diferencia en la respuesta a lo largo del tiempo al tratamiento de las larvas con ivermectina sola», dijo Torres.

«Después de cuatro horas de exposición, todas las larvas de la cepa susceptible [Mozo] habían muerto, mientras que la tasa de mortalidad entre las larvas de la cepa resistente [Juárez] había alcanzado sólo el 40 por ciento. Esta proporción se mantuvo constante 24 horas después de la exposición. La dosis que mató a la cepa susceptible no logró matar a la cepa resistente «.

La segunda batería de bioensayos volvió a utilizar las cepas susceptibles y resistentes, pero en este caso, la solución letal contenía no solo ivermectina sino también uno de los cuatro inhibidores que bloquean la acción de las enzimas desintoxicantes y transportadoras.

Los cuatro inhibidores se probaron individualmente a cinco concentraciones diferentes que iban de 1,88 a 30 micromolar (µM) con el objetivo de determinar los niveles ideales (no tóxicos) de los inhibidores en ausencia de ivermectina. Una vez encontrada la dosis no letal más alta de cada inhibidor, se utilizaron por separado en combinación con ivermectina para explorar el papel de las proteínas en la resistencia a los fármacos mediante su inhibición.

Por ejemplo, si una enzima es responsable de la desintoxicación de la ivermectina y conduce a una reducción de la mortalidad en la cepa resistente de garrapatas, su inhibición conducirá a un aumento de la mortalidad, que puede alcanzar un nivel similar a la tasa de mortalidad de la cepa susceptible.

Los investigadores encontraron que la inhibición de las cuatro familias de proteínas aumentaba la mortalidad en diferentes grados. «Nuestros resultados mostraron que los transportadores ABC jugaron el papel más importante en la resistencia mostrada por la cepa Juárez», dijo Torres. «Cuando se inhibieron con ciclosporina A, las tasas de mortalidad fueron muy similares a las observadas en la cepa susceptible. El uso de otros inhibidores [PBO, DEF y DEM] también condujo a una mayor mortalidad en la cepa resistente, pero las enzimas inhibidas jugaron un papel menos importante en la desintoxicación «.

Durante los bioensayos letales con la cepa resistente (Juárez), los mejores resultados se obtuvieron cuando las larvas se colocaron en una solución que contenía ivermectina y ciclosporina A (CsA) a 12 µM.

Después de que las larvas resistentes fueron expuestas a la ivermectina sola, el 40 por ciento murió en cuatro horas y la misma proporción en 24 horas, mientras que la exposición al pesticida más CsA resultó en la muerte del 50 por ciento en 3 horas y 20 minutos y aproximadamente el 100 por ciento en 24 horas. .

«Curiosamente, el tiempo letal para el 50 por ciento de mortalidad en la cepa resistente cuando se expone a la ivermectina combinada con CsA se asemeja mucho al tiempo letal para el 50 por ciento de mortalidad en Mozo, la cepa susceptible, cuando se expone a la ivermectina sola, lo que evidencia una reversión casi completa de la El fenotipo resistente de la cepa Juárez «, dijo Torres.

«El efecto sinérgico de CsA se demostró por un aumento del 60 por ciento en la mortalidad en la cepa expuesta a la combinación de ivermectina y CsA en comparación con el de la misma cepa expuesta sólo a ivermectina después de 24 horas».

Los resultados proporcionan evidencia de la acción de los mecanismos de desintoxicación en R. microplus resistente a la ivermectina, contribuyendo al conocimiento de la base molecular subyacente al fenotipo resistente a la ivermectina.

«Este conocimiento puede ayudarnos a encontrar nuevas estrategias para lidiar con la resistencia a la ivermectina en el campo», dijo Torres. «Por ejemplo, los inhibidores que probamos u otras moléculas con efectos similares podrían incluirse en formulaciones comerciales de ivermectina».

Las diferencias en las actividades de las proteínas estudiadas podrían deberse a diferencias entre las cepas susceptibles y resistentes en la estructura, secuencia o expresión de los genes que codifican estas proteínas. Como parte del mismo proyecto más amplio, los investigadores ahora están investigando sustituciones en las secuencias codificantes de genes pertenecientes a estas cuatro familias, así como alteraciones en el nivel de su expresión.

«Este análisis nos ayudará a establecer las relaciones causales entre la función genética y la resistencia metabólica a la ivermectina», dijo Torres.

por FAPESP