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aviNews (Espanha)

Evaluación del desempeño y diagnóstico del estrés en pollos

Publicado em 10 maio 2018

Por Fábio Pértille

Los pollos son un organismo modelo ideal para estudios en filogenia, embriología, medicina y diversas áreas de la investigación científica. La proteína de pollo es conocida por poseer un bajo grado de grasa, alto grado de ácidos grasos insaturación y bajos niveles de sodio y colesterol, lo que responde a la demanda actual del consumidor.

Con el fin de obtener patrones óptimos de producción de carne de alta calidad se han alcanzado grandes avances en nutrición y gestión en pollos. Sin embargo, gran parte de dichos avances provienen de la alta presión de selección de los animales en programas de mejoramiento genético para obtener índices óptimos de:

Basado en informaciones genómicas, el uso de técnicas moleculares ha sido una herramienta fundamental para entender genes que controlan características de interés comercial para mejorar las estrategias de selección dentro de los programas de mejoramiento ya existentes

El empleo de técnicas moleculares no solo contribuye a la mejora de la selección, sino también a la comprensión de la historia evolutiva de las aves y de los mecanismos genéticos y epigenéticos involucrados en este proceso evolutivo y en la diversificación genética de esta especie. Este entendimiento también es importante en un contexto humanitario para mejorar las necesidades de los animales y sus ambientes de cría, ya que los modelos actuales de producción a gran escala son cuestionados en relación a la salud y el bienestar animal.

En este sentido, nuestro grupo de investigación en Brasil unió esfuerzos en colaboración con un grupo de investigación en Suecia para la optimización de técnicas moleculares para identificar marcadores que nos ayudarán a entender los genes controladores de características de desempeño y bienestar en pollos.

Secuenciación de próxima generación (NGS)

Para entender los mecanismos moleculares que rigen estas características de interés, especialmente en la última década, surgieron técnicas de secuenciación de alto rendimiento, también llamados secuenciación de segunda generación (NGS, Next-Gen Sequencing)

Estas metodologías proporcionaron una gran cantidad de información que se utilizó tanto para identificar la mutación genética como las variaciones epigenéticas a través de marcadores moleculares llamados polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) y regiones de metilación diferencial en el ADN (DMR).

Los polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) y las regiones de metilación diferencial en el ADN (DMR) pueden ser responsables de cambios funcionales en el genoma del pollo. Es posible localizarlos en regiones genómicas neutras, siendo fundamentales en muchos procesos y actividades genéticas

La secuenciación de segunda generación permitió el desarrollo de paneles de SNPs para identificar asociaciones de éstos con fenotipos de interés. Sin embargo, estos paneles de SNPs tienen cobewerimentales. Aunque la NGS tiene poder suficiente para detectar polimorfismos informativos, su alto costo hace que sea impracticable su uso en el mejoramiento genético animal, en estudios de asociación genómica amplia (GWAS) y en la detección de DMR por inmunoprecipitación del ADN metilado (MeDIPS).

En este sentido, teniendo en cuenta la demanda para la creación de un método con un costo eficiente, realizamos simulaciones in silico para la selección de una enzima de restricción (ER), lo que permitió la secuenciación de una fracción reducida del genoma del ave de forma eficiente, económica, y reproducible para el descubrimiento, caracterización y validación de SNPs y regiones metiladas. Esta estrategia posibilitó la obtención de fragmentos que presentan distribución integral y enriquecen regiones de microcromosomas, que son subrepresentados en los paneles de genotipado disponibles comercialmente.

Las regiones de los microcromosomas son ricas en genes con alto contenido de islas CpG*. La citosina (C) de los dinocleotídeos CpGs, es pasible de metilación en animales, pudiendo ser utilizada como marcador epigenético

Así, a partir de un enfoque desarrollado en Cornell, EE.UU., realizamos una detallada descripción paso a paso de la optimización completa del protocolo reproducible basado en la secuencia reducida del genoma del pollo .

ESTUDIO

A partir de 462 animales genotipados usando este protocolo, fue posible identificar SNPs asociados con características de desempeño en pollo. Parte de estos SNP ya se habían descrito asociados a las mismas características en otras poblaciones, mientras otros revelaron nuevas regiones candidatas. El detalle de estas regiones genómicas asociadas con el desempeño de los animales fueron también publicadas en forma de artículo científico.

La metodología desarrollada, también permitió un perfeccionamiento en la técnica de secuenciación de ADN metilado por inmunoprecipitación (MeDIPseq), ya que nuestro enfoque utilizando RE mostró un patrón de cobertura en el genoma que lo hace único en comparación con otros enfoques. Este perfil incluye, no sólo un enriquecimiento de diferentes regiones funcionales, sino también un alto enfoque en regiones de microcromosomas que son regiones ricas en CpG y que presentan mayor densidad de genes que los macrocromosomas. Esto nos hizo considerar el uso de esta metodología para el desarrollo de otros estudios que involucraran el acceso de perfiles de metilación de individuos.

Tradicionalmente, el análisis de regiones diferenciadamente metiladas (DMR) analiza el genoma completo y tiene un costo elevado. Nuestro descubrimiento posibilitó la reducción del precio de la técnica por medio de la utilización de una ER derivada de la optimización del GBS*. Las CpG enriquecidos por digestión con enzima de restricción se pueden utilizar como centinelas de estrés prolongado.

Utilizamos ADN de eritrocitos de las aves, ya que son células de fácil acceso al campo y de fácil aislamiento en tejido sanguíneo, en condiciones diferentes de cría (jaula vs aviario abierto). Identificamos cientos de regiones diferenciadamente metiladas. Podemos acceder a estas DMR en el repositorio (EMBL-EBI) del European Nucleotide Archive (ENA) bajo el número de acceso PRJEB21356

CONCLUSIÓN

En resumen, nuestro trabajo resultó en el descubrimiento de regiones genómicas asociadas al desempeño en pollos y en la medición de estrés en animales por cuantificación de regiones diferenciadamente metiladas. Esta metodología nos acerca mucho al desarrollo de una herramienta definitiva para el diagnóstico de estrés en animales sometidos a diferentes condiciones de producción. Asimismo, nos aproxima a la aplicación directa de dichas herramientas moleculares en el ambiente productivo.

Este trabajo contó con el apoyo de la CAPES (Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior – Brasil) y actualmente su continuidad recibe el respaldo de la FAPESP (Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de S.o Paulo)