Notícia

Revista Canavieiros

Cana Papaia

Publicado em 01 setembro 2019

Uma espécie de consciência global começou a se estabelecer nos anos 2000: a de que um dos principais meios de evitar o avanço das mudanças climáticas seria o uso de combustíveis renováveis que poderiam substituir os derivados de petróleo. Nisso, o Brasil saltou aos olhos do mundo por seu trabalho com o etanol de cana.

Especialistas notaram que era possível produzir ainda mais etanol se passassem a usar os açúcares que estão no bagaço, ou seja, que estão nas paredes celulares (que contêm a celulose, hemicelulose e pectinas, todos formados por açúcares). Só que havia um problema. Os açúcares, nesse caso, ficam em polímeros complexos que interagem entre si formando um compósito organizado e de difícil acesso.

Com isto, foi colocado o desafio científico de desmontar a parede celular para liberar os açúcares, depois usá-los em fermentação e produzir etanol do bagaço e, se possível, até da palha da cana. Com o avanço das mudanças climáticas e a ciência do século XXI, a produção de combustíveis renováveis, como o etanol, cresceu em importância. Tanto no Brasil como no mundo, pesquisadores passaram a buscar freneticamente por novas enzimas.

Na maioria, escolheram o caminho mais fácil, os micro-organismos. Fungos e bactérias foram alvo de um enorme esforço principalmente no Brasil, EUA e na Inglaterra com a finalidade de montar “coquetéis” enzimáticos capazes de degradar os polímeros da parede celular. O grupo de Marcos Buckeridge, coordenador do INCT do Bioetanol (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia - um dos INCTs apoiados pela Fapesp em parceria com o CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), diretor do Instituto de Biociências da USP e professor do departamento de Botânica do Instituto, havia começado a trabalhar com a cana em 1998 e um ponto crucial para ele era entender quais polímeros estão presentes na parede celular da cana. "Levantamos a literatura e vimos que pouco se sabia sobre isto.

A partir de 2010, passamos então a avançar para entender a química dos polímeros para saber quais tipos de ligação teríamos que quebrar para produzir os açúcares. Éramos um dos poucos grupos trabalhando com foco na cana e suas paredes celulares e levamos alguns anos até publicar os trabalhos científicos que descrevem com precisão as ligações químicas a serem quebradas nas paredes da cana.

Paralelamente, diversos grupos realizavam inúmeros experimentos com coquetéis enzimáticos, misturas de enzimas e enzimas isoladas (sempre de micro-organismos). A ideia, na maioria dos casos, era colocar as enzimas sobre a biomassa e acompanhar a liberação de açúcares. Porém, em todos os casos, apenas uma quebra parcial dos polímeros era obtida. Pesquisadores americanos batizaram esta resistência de recalcitrância”, explica o professor.

Quase vinte anos depois desta onda de experimentos, a recalcitrância das paredes celulares ainda precisa ser melhor compreendida. No entanto, hoje se sabe que existe um “código glicômico” que precisa ser quebrado para também romper a recalcitrância da parede celular. Em meio a tudo isso, Buckeridge teve a ideia de abordar o problema de um ângulo diferente. Como havia trabalhado na primeira fase de sua carreira com a degradação de parede celular em sistemas naturais de árvores brasileiras e havia descoberto que alguns sistemas são extremamente eficientes, pensou: por que não procurar algum fenômeno executado pela própria cana em que ela mesma degradasse a sua parede?

Então, passou a procurar por este fenômeno e o primeiro processo que pensou em investigar foi a senescência (envelhecimento) das folhas. "No campo, as folhas mais velhas da cana se tornam amareladas e caem. Pensamos que talvez este processo incluísse a degradação da parede celular. Investigamos o processo junto a um colega de Brasília, que havia tido uma ideia parecida. Mas logo vimos que as paredes não se modificavam", lembra Buckeridge. Seu grupo continuou fazendo cortes histológicos e olhando os vários tecidos da cana ao microscópio em diferentes condições, na busca de encontrar alguma coisa.

Um dia encontraram algo que parecia ser a resposta num dos lugares menos prováveis: nas raízes da cana. "Vimos que em todas as raízes ocorria um processo de formação de cavidades de ar (chamado de aerênquima), onde víamos as paredes celulares todas colapsadas. Isto indicava que poderia haver modificações nas paredes e o processo poderia nos mostrar como as enzimas da própria cana atuam sobre os polímeros", vislumbra o professor. Ele conta que no período em que tudo isto estava ocorrendo, uma de suas alunas de doutorado havia demonstrado que, nos frutos de papaia, um fenômeno de transformação das paredes celulares ocorria exatamente da forma procurada. Assim, batizou o projeto de “cana papaia”.

A ideia era tentar induzir no tecido da cana uma cascata de fenômenos similares ao que é visto na papaia. Com isso, talvez conseguiriam produzir uma cana que amolecesse, como o fruto da papaia quando amadurece. Assim, poderia ficar mais fácil para a indústria processar o bagaço e a palha e produzir etanol de forma mais rápida e barata. Como sempre é mais fácil falar do que fazer, o desafio era maior do que o imaginado. Era preciso reengenheirar as células da cana para se autodegradarem, mas não totalmente, isto é, só o suficiente para que a indústria possa usar uma matéria-prima melhor adaptada ao processo.

Foi dado um primeiro passo importante com a descoberta do aerênquima. Agora era necessário saber o que acontecia durante a sua formação, buscar os genes responsáveis pela produção das enzimas que degradam os polímeros da parede, entender como estas enzimas agem sobre os polímeros e finalmente desenhar uma estratégia de controle da expressão dos genes da própria cana para poder chegar a algo como a “cana papaia”. Formação do aerênquima Buckeridge esclarece que o processo de formação do aerênquima ocorre em todas as raízes das variedades de cana verificadas. Ele se dá em um tecido chamado parênquima que fica logo abaixo de uma camada dupla de células que é a epiderme (análogo à nossa pele).

Todo este parênquima vai desaparecendo a partir do segundo centímetro da ponta da raiz. E quando se olha para o quarto ou quinto centímetro, já não se vê mais células vivas no parênquima. Tudo vira espaços de gás. "Descobrimos que as células morrem de forma controlada, ou seja, por um processo chamado de morte celular programada. Com o avanço deste processo, sobram paredes celulares que ficam, de um lado, ligadas à epiderme e, do outro, ao cilindro vascular central. Acreditamos que os espaços que se formam servem para facilitar a oxigenação das raízes, tornando o processo de absorção de nutrientes mais eficiente. Porém, esta função ainda não foi comprovada para a cana, mas sim para outras plantas", salienta.

Depois de descrever o que acontece nas paredes durante o processo, foram investigados os possíveis processos de controle. Para isso, novamente foi usada a ideia dos frutos. É bem conhecido que alguns hormônios vegetais, notadamente o etileno e a auxina, estão envolvidos no amadurecimento, que é de fato muito parecido com a formação do aerênquima. Na realidade, em um fruto maduro de papaia, é possível até ver os aerênquimas a olho nu, formados entre a casca e a polpa do fruto. O aerênquima é o que facilita raspar a polpa do fruto maduro da papaia com uma colher.

"Para saber se estávamos tratando, na cana, com um fenômeno similar, fizemos medidas de etileno e auxina nas raízes da cana e vimos que a ideia faz sentido. Mais do que isso, ao olharmos a expressão dos genes na raiz, acabamos encontrando um fator de transcrição (proteína que controla a expressão de genes) que parecia dar início ao processo de separação entre as células. Ao olhar com atenção a literatura, vimos que este fator de transcrição, chamado RAV, havia sido apontado como importante em vários fenômenos similares, como a abscisão (queda) de folhas e o amadurecimento de frutos.

Testamos e vimos que RAV da cana de fato controla uma das enzimas chave no processo de separação celular. Isto forneceu uma evidência mais robusta de que o caminho da cana papaia parecia estar correto", avalia Buckeridge. Foram construídos bancos de dados com mais de um milhar de genes e proteínas de cana relacionado às enzimas que constroem e degradam a parede celular, o que levou à construção de um mapa que descreve uma intrincada rede de correlações entre a produção e ação dos hormônios etileno e auxina, outros fatores de transcrição e genes de parede. Isso resultou em um alto nível de complexidade que demandou o desenvolvimento de dois softwares de análise de redes complexas que permitem lidar com o fenômeno de forma mais adequada.

"Em nosso último trabalho (que foi aceito para publicação na Revista Annals of Botany), descobrimos que a produção de enzimas ao longo da formação do aerênquima envolve uma ação conjunta e organizada na expressão dos genes, produção das proteínas enzimáticas e ação sobre os polímeros. Isto ratificou a ideia de que o processo de degradação da parede celular é altamente organizado e não um processo em que as enzimas são enviadas para a parede para agirem sobre os polímeros ao acaso. Isto diz algo importante sobre como quebrar a recalcitrância e na minha visão mostra que a ideia da 'cana papaia' tem uma visão científica plausível", considera o professor.

Conforme foram entendendo o processo, os pesquisadores perceberam outros pontos importantes que poderiam ser bons candidatos para uso em uma estratégia de reengenharia da planta de cana com um todo. Um deles, obviamente, era o uso do fator de transcrição RAV. "Precisávamos usar esta informação para avançar na biotecnologia da cana para a bioenergia. Produzimos assim plantas com a expressão deste gene (é bom lembrar que o RAV é da própria cana, portanto não é um transgênico) aumentada para avaliar o que poderia acontecer se este gene ficasse expressando continuamente na planta inteira. As plantas já estão crescendo há dois anos e estão sendo avaliadas.

Estas avaliações têm que ser feitas com muito cuidado e com muitas repetições para termos certeza de que as alterações que vemos realmente significam efeitos da alteração do gene. Os resultados até agora são promissores. Temos plantas que não conseguem parar em pé, o que pode significar que suas paredes celulares foram alteradas. Só agora chegamos ao ponto de poder avaliar com segurança e, se a hipótese se confirmar, teremos dado um passo importante em direção à cana papaia.

Se não se confirmarem, teremos que voltar aos planos e buscar novas hipóteses", diz Buckeridge. Recentemente foi descoberto um outro nível de controle do processo, que é o epigenético. Neste nível, uma das formas de controlar a expressão gênica é através de pequenos RNAs (chamados de microRNAs ou miRNAs) que interferem na expressão dos RNAs mensageiros (mRNAs), que são aqueles que irão ser os moldes para a montagem das proteínas dentro das células.

"Descobrimos um conjunto de miRNAs que interferem diretamente na expressão do próprio RAV, além de vários outros membros do grupo de enzimas que atacam as pectinas no início da formação do aerênquima. Isto significa que além dos hormônios e fatores de transcrição, há um rígido controle na expressão gênica que modula a parte inicial do processo. E tudo isto ocorre nos primeiros dois centímetros da raiz", explica. Foi descoberto ainda um outro ponto de controle, mais à frente no processo (entre o terceiro e o quarto centímetro), que é a abertura dos canais de comunicação entre as células (em biologia celular vegetal, estes poros são chamados de plasmodesmos).

Uma enzima que está relacionada à abertura e fechamento dos plasmodesmos e que possivelmente determina quais células irão morrer primeiro foi notada, dando lugar às transformações que irão formar o compósito de paredes celulares transformadas que conferem impermeabilidade aos gases no aerênquima. "Já está claro que para controlar as modificações na parede celular e torná-la mais susceptível ao ataque das enzimas, precisaremos ajustar múltiplos pontos de controle. Com o advento das novas técnicas de edição de genomas (CRISPR-Cas), acredito que temos como produzir a cana papaia mais facilmente do que temos hoje, com técnicas bem mais lentas de transformação do genoma", adianta Buckeridge.

Eureka Apesar de já usarmos o etanol de segunda geração (feito de polímeros da parede celular) em nossos automóveis no Brasil, um dos principais gargalos na produção deste tipo de etanol é a chamada hidrólise enzimática (ou seja, a quebra dos polímeros da parede por enzimas). O custo dos coquetéis enzimáticos comerciais ainda é alto e há uma enorme parcela de zonas obscuras no processo.

A produção da “cana papaia” através de um sistema que possibilite induzir o processo de desmontagem da parede depois da colheita poderia potencialmente economizar muito da energia gasta no processo de moagem da cana, de forma a obter o açúcar livre (a sacarose) e o bioetanol de primeira geração e, com isto, produzir também o bioetanol de segunda geração. Com as paredes celulares alteradas pela própria cana, provavelmente o gasto com enzimas comerciais deveria diminuir, caindo assim o custo de produção.

"O impacto do sistema de produção de cana e etanol brasileiros é enorme. Num trabalho de modelagem em que participamos junto à Universidade de Illinois (EUA), chegamos à conclusão que a expansão da cana pode substituir até 6% da gasolina mundial e diminuir as emissões de gases do efeito estufa em até 14%. Tudo isto sem afetar qualquer área de preservação de florestas ou a produção de comida no Brasil", frisa o professor.

Para ele, a cana papaia poderá ser uma contribuição importante para a produção de etanol como um todo afetando significativa e positivamente o combate às mudanças climáticas. A obtenção da “cana papaia” também deverá afetar a produção de açúcar, visto que a parede celular dificulta o acesso ao açúcar presente no interior das células da cana. Ademais, duas das enzimas encontradas durante os estudos sobre a formação do aerênquima nas raízes de cana já foram expressas em leveduras e poderão ser utilizadas para complementar coquetéis enzimáticos comerciais.

Além do uso na área de biocombustíveis, as enzimas também poderão ser usadas em outros processos industriais como, por exemplo, a produção de sucos de frutas e de alimentos processados. "Em relação aos polímeros da parede celular, encontramos um que pode ser utilizado como antidiabético, podendo assim abrir caminho de uso da biomassa de cana na indústria de fármacos", vislumbra Buckeridge. O próprio funcionamento do aerênquima, que consiste na formação de bolsas de ar, denota a característica de impermeabilidade (ou permeabilidade seletiva) a gases.

Essas características ainda precisam ser melhor estudadas, mas podem implicar em aplicações promissoras dos polímeros da parede celular no uso, por exemplo, em embalagens que têm que ser impermeáveis a gases. Próximos passos Buckeridge conta que no momento seu grupo está caracterizando os dois eventos de transformação genética realizados para o fator de transmissão RAV e uma das enzimas, que provavelmente é crucial no processo de impermeabilidade do compósito, que se forma com o desenvolvimento do aerênquima.

"Caso confirmemos as observações de que as plantas realmente apresentam modificações consistentes em seu comportamento, o próximo passo será colocá-las no campo e ver se o efeito persiste. Ao mesmo tempo, há uma série de outros genes candidatos a serem testados. Esperamos que seja tudo bem mais rápido com os avanços nas técnicas de edição de genomas", acredita. No caso das enzimas de parede de cana expressas em micro-organismos, a ideia é que componham parte de um coquetel enzimático que está sendo desenvolvido no âmbito INCT do Bioetanol, no qual grupos de pesquisa de São Paulo (Ribeirão Preto e São Carlos), do Paraná (Maringá e Curitiba) e do Rio Grande do Sul (Pelotas) interagem.

Um coquetel enzimático brasileiro que seja eficiente abre caminho para novas empresas nacionais no setor e complementa a estratégia da “cana papaia” no sentido de ter uma planta que amolece como um fruto e que depois tem suas paredes celulares desmontadas por um conjunto de enzimas ajustadas à biomassa da cana.

"Temos esperança de aumentos significativos de eficiência no processo de produção de etanol de segunda geração com estas estratégias", frisa Buckeridge. Apesar de todos os estudos e descobertas, ainda é difícil precisar quando a "cana papaia" estará disponível nos canaviais porque ainda faltam várias confirmações antes de ter plantas que indiquem que o que foi visto no laboratório ocorrerá também no campo.

"Ainda estamos na fase de caracterização dos transgênicos, o que pode levar pelo menos mais um ano. Porém, há um avanço rápido nas novas técnicas de edição de genes (CRISPR-Cas) que, quando passarem a ser usadas como rotina em cana, nos auxiliará muito na aceleração do processo de tornar a “cana papaia” comercial. Porém, mesmo que consigamos isto rapidamente, o processo de levar um produto como a “cana papaia” para um nível comercial exige a interação entre pesquisa-empresa-governo.

Quero dizer que, para que a “cana papaia” se torne comercial será necessário que uma empresa adote a estratégia de tê-la como um possível produto. Um outro ponto importante é que, por se tratar de uma planta modificada geneticamente, será necessário passar pela Comissão Federal de Biossegurança", atenta o professor. Biotecnologia Sabemos que a biotecnologia da cana já está em andamento há muito tempo. Buckeridge explica que a produção de variedades por técnicas de genética clássica é uma biotecnologia tão ou mais importante do que fazer transgênicos ou geneticamente modificados.

O avanço agora está na compreensão do que foi feito no nível do genoma, olhado por anos somente para o lado de fora das plantas. "À medida em que entendemos melhor o que aconteceu, vamos adquirindo cada vez mais conhecimentos estratégicos para refazer melhor ainda. A nossa parte neste processo é entender o funcionamento e ajudar a produzir as informações necessárias para adquirirmos controle cada vez mais preciso sobre os processos que poderiam ser modificados para adequar ao uso humano.

Alguns são óbvios agora como os modos de fazer a cana crescer ainda mais rápido e produzir mais açúcar e mais biomassa, fazer com que as plantas se defendam melhor de doenças e com que a extração do açúcar de primeira e segunda geração sejam mais fáceis. Mas há muitas outras possibilidades para o futuro", enumera.

As descobertas sobre o complexo sistema que pode levar à “cana papaia” poderiam também remeter à busca de modificações já existentes em variedades de cana. Com isso, poderão ser introduzidas características no melhoramento genético ainda não utilizadas, chegando a variedades com algumas das características da “cana papaia” que possam ajudar na produção do etanol de segunda geração. Esta estratégia já foi iniciada no INCT do Bioetanol e está avançada.

"Conforme o conhecimento sobre o genoma, a expressão gênica, metabolismo e a fisiologia da cana forem avançando, esta planta poderá ser usada não somente como produtora de biomassa, mas como uma verdadeira biofábrica de compostos úteis", finaliza Buckeridge.