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A estratégia utilizada na Unifesp torna imaginável sondar o genoma do novo coronavírus com resolução

Publicado em 02 setembro 2021

Cientistas da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) conseguiram, pela primeira vez no Brasil, sequenciar o RNA do SARS-CoV-2, o vírus causador do COVID-19. Os efeitos da pesquisa, apoiados pela FAPESP, foram publicados em artigo que ainda não foi revisado por pares na plataforma bioRxiv.

Segundo os autores, a estratégia torna imaginável mapear o genoma viral com cerca de 25 vezes mais solução do que os métodos tradicionais de sequenciamento, desta forma é imaginável ter um conceito mais preciso da biologia do patógeno e da evolução de seu genoma.

“Isso é muito promissor, porque nos ajuda a entender, por exemplo, por que existem cepas mais virulentas ou mais capazes de escapar do nosso sistema imunológico”, diz Marcelo Briones, pesquisador do Centro escola de Bioinformística Médica. (EPM) da FAPESP -Unifesp) e coordenador de estudos.

Como briones explica, SARS-CoV-2 é um vírus RNA de fios solteiros, ou seja, sua genética é composta de uma única cadeia nucleotídea, cujas bases são guanina, adenosina, citosina e uracil. Método, uma estratégia conhecida como RT-PCR (polimerase transcriptase reversa) é usada para converter moléculas de RNA em DNA complementar (cDNA), lembrando que a molécula de DNA tem a forma de duas cadeias de nucleotídeos, ou seja, uma cópia complementar da cadeia de RNA Essas moléculas de CDNA são amplificadas (bilhões de clones são gerados) e colocadas em série. Entre os benefícios da estratégia estão a velocidade e a opção de sequenciamento mesmo em amostras com muito pouca matriz genética.

“O sequenciamento convencional desse vírus é como caçar para identificar um usuário apenas através de sua sombra. Com a abordagem utilizada em nosso estudo, podemos dar uma olhada direta no RNA viral como descoberto in vivo. É muito mais confiável”, diz o pesquisador.

Metodologia

Carla Braconi, professora do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da EPM-Unifesp e coautora do artigo, diz que estudos realizados com uma das primeiras cepas remotas de SARS-CoV-2 no Brasil no início de 2020.

“Vencemos o isolamento viral do professor José Luiz Proença-Modena [da Universidade Estadual de Campinas] e cultuamos o patógeno em vero móviles [linha móvel de rim de macaco muito sensível ao SARS-CoV-2]. Em seguida, extraímos o RNA viral e o sequenciamos com uma geração portátil de MinION, da Oxford Nanopore Technologies”, diz ele.

De acordo com Briones, o RNA é sequenciado precisamente quando sai da célula vero, contornando RT-PCR ou amplificação. “Nós simplesmente ‘enganramos’ um adaptador ao final da molécula e um fio de cDNA para que o fio de RNA se exerça e, em seguida, apenas o RNA passa, base por base, para o sequenciador. E cada tipo de base [citosina, guanina, adenosina ou uracil] e suas modificações, como a metilação, interrompem a eletricidade do dispositivo com outra tendência e é assim que identificamos quem é o quê.

O procedimento produz um gráfico que se assemelha a um eletroencefalograma, que é então interpretado com ferramentas bioinformáticas. A última série gerada pode ser para os modelos de referência.

“Inicialmente, temos a impressão de que a série recebeu tem muitos erros. Mas, na realidade, essas são as bases de RNA alteradas. E alguns desses ajustes passam despercebidos pelo sequenciamento”, diz o pesquisador.

A análise, realizada por meio do pós-doutorado João Campos, focou no modelo de metilação rna viral, ou seja, buscamos, entre as quase 30 mil bases que compõem o RNA de encalhe única, que obteve a incorporação de um radical metil. (CH3).

“Esse tipo de alteração bioquímica do RNA é muito útil para o bom funcionamento de vírus como o SARS-CoV-2, bem como algumas arboviroses [incluindo dengue e Zika] que são componentes do Grupo Quatro do sistema de classificação de Baltimore, composto por genomas virais trançados -RNA e polaridade positiva”, explica braconi.

Os autores explicam que as RNAs às vezes têm cem bases alteradas que são imprescindíveis para suas funções biológicas. “Uma vez que o SARS-CoV-2 entra no celular e o “força” a fazer cópias de seu material genético, uma enzima parece metilar esses RNAs e esses ajustes começam a desempenhar um papel. Eles são parte dos dados que o vírus quer sobreviver. Sem analisar esse padrão de metilação, não é imaginável conhecer a verdadeira riqueza genética do SARS-CoV-2?, explica Briones.

Uma base diferente no SARS-CoV-2 RNA é n6-metiladenosina (m6A), que lida com a evasão da resposta imune. “Essa alteração permite que o vírus escape da fórmula de ativação de interferon [proteínas produzidas através de células de defesa antivirais]. Então é um alvo prospectivo para drogas e já existem estudos sobre isso”, diz Briones.

Se fosse imaginável criar uma droga capaz de bloquear absolutamente o procedimento de metilação do RNA viral, diz o pesquisador, o novo coronavírus desapareceria das células e seria o fim do COVID-19. “O desafio é que se bloquearmos demais a metilação, as células hospedeiras também acabam morrendo, pois as enzimas que se formam no RNA viral são as mesmas que metilam o RNA nas células, então tem que ser qualquer coisa com uma ação muito expressa.

Tecnologia disruptiva

A organização da Unifesp foi pioneira no sequenciamento direto do SARS-CoV-2 RNA, juntamente com a identidade das bases m6A. As pinturas feitas nos quadros da tarefa temática “Investigação de elementos induzidos pela reação às vacinas em americanos submetidos a ensaios clínicos com a Vacina ChAdOx1 nCOV-19”, coordenada pelo professor Luiz Mário Janini. Também participaram as pesquisadores Juliana Maricato e Fernando Antoneli.

“Em duas das pinturas publicadas no passado [por equipes do exterior], apenas o sequenciamento do RNA foi realizado. Um terceiro também realizou sequenciamento direto, mas conhecia a base de 5mC. Há também uma quarta pintura que conhecia a mesma base m6A, mas outras técnicas que não envolvem sequenciamento direto do RNA”, diz Briones.

Segundo o pesquisador, este detalhado de como o genoma do novo coronavírus funciona permite que os cientistas tenham um conceito mais preciso da evolução do patógeno.

“As pessoas que se comunicam sobre as mutações pelas quais o vírus sofre, que estritamente falando correspondem a ajustes de uma base para outra na série RNA, estão, na minha opinião, presas no paradigma do DNA. Isso não faz sentido, porque este vírus funciona de acordo com alguma outra lógica. Ele nunca tem DNA em seu ciclo replicativo e por assim dizer de “transcrições” deste vírus é absurdo. O ARS-CoV-2 vive absolutamente no RNA global”, diz Briones, referindo-se à hipótese global do RNA, de que o global existente, com vida fundada principalmente em DNA e proteínas, precedeu um global no qual a vida foi fundada no RNA.

“O ponto de complexidade da molécula de RNA é comum e, com novas tecnologias que tornam possível a sequenciamento direto, um novo universo de estudos está se abrindo. Fizemos esse exercício no começo. Ainda haverá muito desenvolvimento, mas esse é o caminho a seguir”, diz.

O próximo passo da Unifesp será realizar uma série de RNA genômicas das recém-conhecidas variantes SARS-CoV-2 e investigar se há diferenças significativas no padrão de metilação.

O sequenciamento direto do RNA mostra que os locais m6A do SARS-CoV-2 e uma metilação diferencial imaginável do motivo DRACH podem ser lidos entre variantes em www. biorxiv. org/content/10. 1101/2021. 08. 24. 457397v1.

Este texto foi originalmente publicado através da Agência FAPESP sob a licença Creative Commons CC-BY-NC-ND.

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